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Evaluación de la actividad antifúngica del extracto de Datura stramonium
sobre hongos fitopatógenos del tomate
Evaluation of antifungal activity from extracts of Datura stramonium against
tomato phytopathogenic fungi
Lina Maria Otalvaro Rincón1, Ana Cecilia Caro Zapata, Brayan Roldan
Mesa, Carlos Andres Nore
RESUMEN
El deterioro de los tomates por el efecto de los hongos fitopatógenos ha sido reconocido como una
fuente de posible peligro para la salud humana y animal. La especie vegetal Datura stramonium
posee una alta actividad biológica antifúngica, debido a la presencia de alcaloides tropánicos. En
este trabajo se evaluó la actividad de control fúngico de los extractos preparados con la flor y la
semilla de esta especie. En los ensayos se midió el diámetro de crecimiento de un hongo nativo
del cultivo de tomate en un medio sólido PDA (agar papa dextrosa) que estaba enriquecido con
100 µl (microlitros) de los extractos obtenidos de las partes de la especie vegetal. Los porcentajes
de inhibición encontrados fueron del 90 % y del 100% para los extractos de la flor y la semilla
respectivamente. Con el fin de identificar la naturaleza química de los metabólitos extraídos que
presentaron actividad antifúngica, se realizaron análisis mediante cromatografía líquida
HPLC/UV, y espectrofotometría IR. Este estudio permitió confirmar que los metabolitos extraídos
fueron alcaloides tropánicos, pero con algunas sustancias diferentes para los extractos de la semilla
y la flor.
Palabras claves: Solanum lycopersicum, fungicida, extractos naturales, alcaloides, plagas.
ABSTRACT
The deterioration of tomatoes due to the effect of fungi has been recognized as a source of possible
danger to the health of humans and animals. Datura stramonium has high antifungal activity, due
to the presence of tropanic alkaloids. In this work the activity of the extracts from the flower and
the seed of the plant Datura stramonium is evaluated, measuring the diameter of the growth halo
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of a native tomato fungus in a solid PDA medium enriched with 10 microliters of extract. The
percentages of inhibition were 90% for the extract of the flower and 100% for the extract of the
seed, since day 2 of the test. In order to identify the chemical nature of the metabolites that are
antifungal activity, the results with liquid chromatography HPLC / UV, and IR spectrophotometry.
This study confirmed that the extracted metabolites were tropanic alkaloids, but that different
sources of their source were seeds or flowers.
KEYWORDS: Solanum lycopersicum, fungicide, natural extracts, alkaloids, plague.
INTRODUCCIÓN
La finalidad de la agricultura es la de satisfacer las necesidades de alimentos y fibras de los seres
humanos, estas son mayores a medida que aumenta la población mundial, como se espera que para
el año 2025 la población alcance de 6,3 a 8,5 mil millones de habitantes. Estos aumentos requerirán
de un incremento de la producción agrícola de aproximadamente un 40 a 50 % para mantener el
nivel actual de insumos de alimentos.(FAO, 2009; Unemployment, Skills, & Programmes, 2011)
En la mayoría de los países en vía de desarrollo, la principal fuente de nutrientes la constituyen
los alimentos de origen vegetal, de los cuales los cereales y las hortalizas ocupan un lugar muy
importante. (Fao, 2007). El tomate (Solanum lycopersicum L), es la hortaliza más difundida en
todo el mundo y la de mayor valor económico siendo; China, EE.UU y Turquía los mayores
productores. El cultivo del tomate ocupa una superficie anual de 4.803.680 con un rendimiento a
nivel mundial de 33,68 ton/ha(FAO, 2010) y (Alarcon, 2018). En América del Sur, Chile es un
gran exportador de puré de tomate, y Brasil produce aproximadamente 3 millones de toneladas de
tomate. (PlagasyDesinfeccion, 2018), (Systems, 2018) y (Cámara de Comercio de Bogotá, 2018).
La producción de tomate en Colombia es común en casi todas las zonas del país. Sin embargo, el
departamento del Norte de Santander lidera la producción, participando con el 29% del total de la
producción nacional, seguido de Antioquia con 11,4%, Boyacá con 11,3%, Santander con 10,4%
y Cundinamarca con el 6,5% (Ministro de Agricultura y Desarrollo Rural, 2017), (Cámara de
Comercio de Bogotá, 2018)
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Los frutos del tomate representan uno de los componentes más frecuentes de la dieta humana,
debido a su notable riqueza en: vitaminas, azúcares, compuestos antioxidantes, pigmentos
carotenoides, microelementos, metabolitos segundarios, sales minerales y fibras, así como sus
excelentes cualidades gustativas, que mejoran el apetito y contribuyen con la digestión de
alimentos. (Elein Terry-Alfonso, Mayo-agosto, 2018) y (Luna-Guevara, 2014). Algunos de estos
compuestos se relacionan con la prevención de enfermedades como el cáncer, la inflamación del
colon y el síndrome de degeneración muscular, principal causa de ceguera en gente mayor de 65
años.(Bobo, 2014; Hernández, Politécnica, & Orihuela, 2016).
El cultivo de tomate se ve influenciado por unas variables ambientales como la temperatura,
humedad, tipo de suelo y luminosidad que causan efectos diferenciales que lo favorecen o afectan;
además de los controles con sustancias químicas (plaguicidas) aplicadas para evitar plagas
asociadas al cultivo. Este es un fruto que madura en verano, necesitando así; temperaturas que
durante el día oscilan por los 25°C, y durante la noche entre los 10°C y 15°C. Este cultivo se
puede ver afectada por varios microorganismos fitopatógenos, los cuales pueden generar deterioro
en el sabor, olor, color, apariencia o textura de los frutos. (Elein Terry-Alfonso, Mayo-agosto,
2018) y (Luna-Guevara, 2014)
Los hongos son una de las principales fuentes de deterioro del tomate, siendo los más destacados
Aspergillus phoenicis, Absidia spp, Trichoderma spp, Alternaria alternata, Fusarium oxysporum,
Fusarium moniliformis, Aspergilli us niger, Mucor spp, Rhizopus stolonifer, Penicillium spp,
Geotrichum spp y Phytophthora spp (Etebu, Nwauzoma, & Bawo, 2013; Musa, Sani, & Aliero,
2011)(Etebu et al., 2013). Este deterioro por efecto de los hongos, ha sido reconocida como
fuente de posible peligro para la salud humana y animal debido a que durante la infestación se
producen diferentes tipos de micotoxinas, sustancias que en cantidades muy pequeñas son toxicas
capaces de generar graves efectos sobre la salud después de la ingestión o inhalación (Musa et al.,
2011) y (Organización Panamericana de la Salud OPS, 2018)
Para contrarrestar la propagación de estos microorganismos (hongos) se han utilizado diferentes
alternativas como son los fungicidas sintéticos, los cuales han sido una buena alternativa. Pero
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estos productos al presentar una alta concentración de sustancias químicas nocivas, han ocasionado
efectos negativos para los consumidores y los cultivos mismos y provocando la contaminación de
la estructura de la planta, el suelo, el aire y a su vez las fuentes hídricas por el efecto de la
escorrentía. (Alarcon, 2018) (Elein Terry-Alfonso, Mayo-agosto, 2018) (PlagasyDesinfeccion,
2018)
En un intento de modificar esta condición, se han adoptado algunos métodos alternativos de
control, los esfuerzos recientes se han centrado en desarrollar métodos de biocontrol
ambientalmente seguros, duraderos y efectivos para el manejo de los microorganismos que afectan
los cultivos. Estos surgen principalmente de especies vegetales naturales que presentan principios
activos específicos que son una opción para el control de los microorganismos en las plantas
(Kagale, Marimuthu, Thayumanavan, Nandakumar, & Samiyappan, 2004) (Nashwa & Abo-
elyousr, 2012). Además, los biocidas de origen vegetal en general no son fitotóxicos, son
sistémicos y fácilmente biodegradables, estos pueden reducir las poblaciones de patógenos foliares
y controlar el desarrollo de la enfermedad, por lo que se puede decir que estos extractos de las
plantas tienen un potencial como alternativas en programas integrados de manejo de plagas, sin
efectos hasta ahora identificados al ambiente, personas y animales por venir de componentes
naturales. (Bowers & Locke, 2004; Mercurialis, 1996).
Figura 1. Especie vegetal Datura stramonium. Fuente:
autores
La especie vegetal Datura stramonium (ver figura 1) o
localmente llamado borrachero es una planta de la familia
Solanácea. El término Datura se refiere a especies de
arbustos o plantas herbáceas que se producen en forma de
trompeta con flores blancas o púrpuras, con corolas grandes
que miden 6 cm de largo aproximadamente, las hojas miden 20 cm de largo y son ovaladas, con
un borde ondulado y grueso. (Boros et al., 2010).
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Esta planta según revisiones bibliográficas, contiene en la mayoría de sus partes una gran cantidad
de alcaloides ricos en atropina, escopolamina e hioscinamina, por lo cual ha sido empleada con
fines alucinógenos, sin embargo sus extractos han sido ampliamente estudiados para el control de
diversos hongos fitopatógenos. (Luna-Guevara, 2014) , (Elein Terry-Alfonso, Mayo-agosto, 2018)
Sharma y colaboradores reportan que las sustancias presentes en la especie Datura presenta
porcentajes de inhibición del crecimiento de los hongos en Rhizoctonia solani, R.bataticola,
Fusarium solani y F. moniliforme entre el 76 y el 88% por la actividad de los extractos alcohólicos
de las hojas (Sharma, Srivastava, Verma, Niwas, & Singh, 2014). Rodino y colaboradores reportan
que los extractos de Datura stramonium L, Xanthium strumarium L, Rosmarinus officinalis L. y
Artemisia absinthium L mostraron actividad antifúngica mediante la inhibición del crecimiento
micelar en Alternaria alternata. (Rodino, Butu, Petrache, Butu, & Cornea, 2014). Lo cual es un
resultado similar a lo reportado por Sasode y colaboradores sobre el hongo Alternaria brassicae.
(Sasode, Prakash, Gupta, & Pandya, 2012). Sahu y colaboradores reportan que extractos de Datura
stramonium L. mostraron 34,65% de inhibición del crecimiento micelar en Alternaria solani
(Sahu, Khare, & Patel, 2014).
Por lo tanto este trabajo tiene como objetivo principal evaluar el efecto antifúngico de extractos de
partes de la flor y semillas de la especie vegetal Datura stramonim sobre hongos fitopatógenos
como Fusarium ssp del tomate en condiciones de laboratorio.
MATERIALES Y MÉTODOS
Recolección de las plantas
De la especie vegetal Datura stramonium ssp se recolectaron las flores y los frutos (las semillas)
en la Loma del Escobero en la ciudad de Medellín coordenadas 6°08´10.0” N 75°33´15.8” W –
Colombia que pertenece a la zona tropical, en una época de verano en una zona semirrural donde
se presenta esta planta en los jardines de las viviendas. (öz arık, 2017)
Obtención de los extractos de la planta Datura stramonium
Se pesó aproximadamente 200 g de la semilla y/o la flor para cada extracto, previamente seca y
molida, el proceso de secado se realizó a 45°C en un horno de secado con aire forzado marca
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Binder, luego fue molido en un molino de cuchillas marca IKA. Posteriormente se procedió a hacer
un desengrasado, agregando 50 ml de hexano y se dejó en contacto durante dos días protegida de
la luz. Después de este tiempo se separó la capa hidrofóbica y luego se realizó la extracción a 60
g del material desengrasado mediante el método soxhlet con 350 ml de una mezcla de etanol y éter
de petróleo en proporciones 1:2 a 220°C por 12 horas. Posterior a este tiempo el extracto se llevó
a rotavaporar a 40°C y una presión de 335 milibares en un rotoevaporador marca Buchi,
obteniendo alrededor de 45 ml de extracto para las flores y semillas.
Evaluación de la actividad antifúngica del extracto en hongos fitopatógenos del tomate.
La evaluación de la actividad antifúngica de los extractos se realizó mediante una prueba de
inhibición del crecimiento radial de un hongo fitopatógeno, este último aislado desde plantas
enfermas de tomate. Para el aislamiento del hongo se tomaron segmentos de las plantas con
presencia de hongos filamentosos o zonas enfermas. Estos segmentos fueron cultivados en agar
papa dextrosa (PDA) a 28°C hasta el desarrollo de colonias. Posteriormente con ayuda del
microscopio se tomaron muestras de hifas y se cultivaron en el medio solido PDA para su
purificación. Finalmente se seleccionó un moho con características morfológicas (macro y
microscópicas) compatibles con Fusarium ssp que fue el hongo fitopatógeno estudiado.
Para la prueba de inhibición tanto para extracto de flores como de semillas se emplearon cajas
Petri de 10 cm de diámetro con medio solido PDA, este último preparado según las indicaciones
del fabricante y enriquecido con 100 μL del correspondiente extracto, lo anterior con el fin de no
alterar significativamente los demás componentes del medio. Los blancos fuero medios solidos
que se enriquecieron con los solventes empleados en la extracción, la finalidad de estos blancos
fue descartar el efecto del solvente sobre el crecimiento del hongo, así mismo se realizaron
controles negativos con medios sin alteración alguna. Los medios fueron inoculados en el centro
con discos de 1 cm de diámetro del hongo fitopatogeno que llevaba 8 días de crecimiento. Las
cajas Petri fueron selladas, incubadas a 28°C y monitoreadas por espacio de 20 días. Se hicieron
mediciones a las 24, 48, 72 horas y 20 días, determinando el crecimiento radial por mediciones del
diámetro de las colonias (Lizcano, 2007). De este ensayo se realizaron 5 réplicas, con resultados
muy similares.
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Caracterización química de los extractos
Análisis del extracto mediante cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC)
Los extractos se caracterizaron mediante un equipo HPLC cromatografía líquida acoplada a
detector ultravioleta/visible marca Thermo Scientific, modelo Accela 600, utilizando una columna
C
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de 150 mm de longitud y 4,6 mm de diámetro interno, con fase móvil que fue un gradiente que
inicia de tiempo 0 con 5% de acetonitrilo y 95% de agua y termina en un tiempo de 30 minutos
con un 100% de acetonitrilo, utilizando un detector ultravioleta con arreglo de diodos y se
observaron los picos del cromatograma en un rango de longitud de onda entre 210 nm y 360 nm,
las muestras de los extractos para flores y semillas previamente se filtraron a través de un acrodisco
de nylon de tamaño de poro de 0,2 µm en un vial de 1,5 ml.
Análisis por espectroscopia infrarrojo (FT-IR)
Los extractos de las flores y las semillas se caracterizaron por espectrofotometría infrarroja con
transformada de Fourier (FT-IR), en un equipo marca Thermo Scientific, modelo Nicolet IS10;
para identificar los grupos funcionales presentes en los extractos de los metabolitos obtenidos
según referencias bibliográficas y experiencia de los autores para estas sustancias.
Resultados y discusión
Actividad antifúngica de los extractos de las flores y semillas de Datura stramoniun
Como se aprecia en las figuras 2 y 3, los medios enriquecidos (agares) con los extractos obtenidos
de las flores y semillas de Datura stramoniun, presentaron porcentajes de inhibición altos desde
el primer día de cultivo que permanecieron durante los 20 días restantes. De manera particular para
el extracto obtenido desde la flor de D. stramonium se obtuvo en promedio para todas las réplicas
un 90% de inhibición, mientras el extracto de las semillas presentó una inhibición del 100 % para
todas las réplicas. Lo anterior es acorde con lo reportado por otros autores como los anteriormente
nombrados sobre el efecto de D. stramonium en plagas del tomate por hongos. (Sahu et al., 2014;
Ravikumar & Garampalli, 2013).
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Figura 2. Porcentajes de inhibición de los extractos de la flor y la semilla de la planta Datura
stramonium sobre los hongos del tomate. Fuente: Elaboración propia.
Figura 3. Inhibición del crecimiento del hongo debido a los extractos de la flor (izquierda) y la
semilla (derecha), comparado con el control (centro) en medio solido PDA. Fuente: Elaboración
propia.
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Caracterización química de los extractos
El estudio de la composición química de los extractos de la flor y la semilla de la planta Datura
stramonium por cromatografía líquida HPLC permitió inferir sobre la polaridad de los compuestos
presentes en los extractos y sus longitudes de onda de absorción en el rango ultravioleta.
Según los cromatogramas obtenidos a una longitud de onda de 254 nm (Figuras 4 y 5), en los dos
extractos se observa un pico pronunciado en un tiempo de retención de 14 min para el extracto de
la flor (Figura 4) y 16 minutos para el extracto de la semilla (Figura 5), estos picos de acuerdo a
los tiempos de retención y a su apariencia son compuestos de polaridad media que poseerían una
estructura similar dado que los tiempos de retención en ambos cromatogramas son muy cercanos,
pero no se trata de la misma sustancia porque los tiempos de retención no coinciden. Según la
revisión bibliográfica es normal que los extractos de los alcaloides tropanicos presente espectros
con tiempos de retención de hasta 2 minutos de diferencia indicando que son de la misma familia
química (alcaloides) pero que son diferentes sustancias.
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Figura 4. Cromatograma HPLC/UV del extracto de la flor de Datura stramonium. Fuente:
HPLC.
Figura 5. Cromatograma HPLC/UV del extracto de la semilla de Datura stramonium. Fuente:
HPLC.
Según el grafico de contornos en los que se superponen los cromatogramas y los espectros de cada
especie (Figuras 6 y 7) se observa que las sustancias eludidas en los tiempos de retención de 14
min en el extracto de la flor y de 16 min en el extracto de la semilla absorben luz ultravioleta en
el rango de longitudes de onda de 220 nm a 260 nm, lo que indicaría la presencia de alcaloides
tropánicos o derivados de la escopolamina (Hassan, 1990).
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Figura 6. Diagrama de contornos Cromatograma HPLC y espectro ultravioleta del extracto de la
flor de Datura stramonium. Fuente: HPLC
Figura 7. Diagrama de contornos Cromatograma HPLC y espectro ultravioleta del extracto de la
semilla de Datura stramonium. Fuente: HPLC.
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Para tener una aproximación a los grupos funcionales presentes en las moléculas extraídas de las
flores y semillas de las especies vegetales, se tomaron los espectros infrarrojos de cada uno de los
extractos (Figuras 8). Allí se evidencia la presencia de los picos correspondientes a los grupos
funcionales de los alcaloides tropánicos presentados en la Tabla y que son señalados en el espectro,
en el lado derecho se presentan las formulas químicas de las sustancias.
Figura 8. Espectro infrarrojo del extracto de la semilla (color azul) y de la flor (color rojo) de la
planta Datura stramonium. Fuente: Elaboración propia.
Tabla. Grupos funcionales encontrados en los extractos de la flor y la semilla de la planta
Datura stramonium.
Frecuencias
(cm
-1
)
O-H
(3000-3700)
C=C
(1600-1675)
C=O
(1735)
C-N
(1000 – 1100)
C-O
(1000 – 1300)
Extracto Flor
-
+
+
+
+
Extracto
semilla
+
+
-
+
+
Fuente: Elaboración propia.
Conclusiones
Escopolamina
Tropano
Hiosciamina
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1. Para los ensayos de laboratorio con hongos fitopatógenos del tomate los extractos de la flor
y la semilla de la especie vegetal Datura stramonium presentan inhibición en el crecimiento
del hongo de 90 y 100% respectivamente, mostrando que las sustancias extraídas si actúan
como biocidas en las condiciones de preparación de los extractos.
2. Para concluir esta investigación seria importante realizar ensayos en campo donde se
verifiquen los resultados obtenidos en condiciones de laboratorio y las concentraciones de
aspersión que deben utilizarse, igualmente realizar la evaluación de las sustancias y sus
residuales en los tomates.
3. Por las condiciones de preparación de los extractos de la flor y semilla, los ensayos de
laboratorio y las caracterizaciones químicas en el HPLC y en espectroscopia infrarroja, se
evidencia que los metabolitos responsables de la actividad antifúngica fue debida a los
alcaloides tropánicos como Escopolamina, Tropano y Hiosciamina presentes en la especie
vegetal Datura stramonium
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