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Modificaciones en medios de cultivo aplicadas en conservación y producción in-vitro de
orquídeas
Modifications in cultivation media applied in preservation and in-vitro production of
orchids
Juan Manuel Salgado
1
Laura Peñaranda
2
doi:http://dx.doi.org/10.23850/24220582.1393 Recibo: 10.05.2018 Aceptado: 27.03.2019
Resumen
Las orquidáceas son una familia de plantas con interés económico y científico dada su
diversidad ornamental y aplicaciones en la medicina entre otras. Sin embargo, muchas especies
de orquídeas están amenazadas y en peligro de extensión, debido a la transformación del hábitat
y la extracción excesiva de especies con interés comercial. Aunado a esto, su propagación y
conservación in vitro, resulta costosa, debido a la complejidad biológica. El presente estudio
reporta información sobre un medio de cultivo versátil, enfocado en la conservación de
germoplasma y producción in-vitro de orquídeas. Para ello se diseñó una formulación basada
en la modificación del medio Murashige y Skoog (1962) con vitaminas Morel, agua de coco y
carbón activado recurriendo a la combinación de experiencias exitosas de la bibliografía
reportada. Se recolectaron en el eje cafetero, cápsulas de Prosthechea fragrans
(Sw.) W.E.Higgins y esterilizadas en el laboratorio. Los medios de cultivo fueron probados
para la inducción de callo, proliferación de estructuras tipo protocormos, desarrollo y
mantenimiento de plántulas. Se logró la germinación asimbiótica in-vitro de las de semillas
colectadas, se obtuvieron tres tipos de callos. Luego de 7 meses de cultivo, las plántulas
alcanzaron entre 1,1. Se validó el protocolo de esterilización de las cápsulas así como el
protocolo de preparación de medio, siembra y subcultivo, respecto a los resultados reportados
en la literatura usando medios de cultivos convencionales. Los resultados muestran que las
modificaciones realizadas en el medio de cultivo MS, permiten disminuir en 10% los costos
del medio de cultivo y hacerlo versátil, permitiendo la micropropagación y mantenimiento de
plántulas de Prosthechea fragrans (Sw.) W.E.Higgins; presentes en el eje cafetero y el
1
Universidad Tecnológica de Pereira; Correo: manuchem@utp.edu.co; Colombia.
2
Tecnoparque-SENA Nodo Pereira; Correo: lvpenaranda9@misena.edu.co; Colombia.
2
establecimiento de un banco de germoplasma con fines de conservación y producción de
material vegetal de alta calidad derivado del cultivo in vitro.
Palabras Clave: Orchidaceae, Germoplasma, germinación asimbiótica, Embriogénesis
cigótica, Protocormos.
Abstract
The orquidáceas are a family of plants with economic and scientific interest given their
ornamental diversity and applications in medicine among others. However, many species of
orchids are threatened and in danger of extension, due to the transformation of the habitat and
the excessive extraction of species with commercial interest. Added to this, its propagation and
conservation in vitro, is expensive, due to the biological complexity. The present study reports
information on a versatile culture medium, focused on the conservation of germplasm and in-
vitro production of orchids. To this end, a formulation was designed based on the modification
of the Murashige and Skoog (1962) medium with Morel vitamins, coconut water and activated
carbon, using the combination of successful experiences from the reported literature. Capsules
of Prosthechea fragrans (Sw.) W.E.Higgins were collected in the coffee axis and sterilized in
the laboratory. The culture media were tested for callus induction, proliferation of protocormos
type structures, development and maintenance of seedlings. Asymmetric germination in-vitro
of collected seeds was achieved, three types of callus were obtained. After 7 months of
cultivation, the seedlings reached between 1.1. The sterilization protocol of the capsules was
validated as well as the protocol of preparation of medium, sowing and subculture, with respect
to the results reported in the literature using conventional culture media. The results show that
the modifications made in the MS culture medium, allow to reduce the costs of the culture
medium by 10% and make it versatile, allowing the micropropagation and maintenance of
seedlings of Prosthechea fragrans (Sw.) W.E.Higgins; present in the coffee axis and the
establishment of a germplasm bank for the conservation and production of high quality plant
material derived from in vitro culture.
Keywords: Orchidaceae, Germplasm, asymbiotic germination, zigotic embryogenesis,
protocormos, Prosthechea fragrans
3
Introducción
Las orquídeas juegan un papel importante en los sistemas tradicionales de medicina, ya
que poseen gran cantidad de sustancias importantes (Bai, 2015; S. N. T. M. N. Banerjee, 2013;
Pradhan, Regmi, Ranjit, & Pant, 2016; Pradhan, Tiruwa, Subedee, & Pant, 2014; Utami,
Hariyanto, & Manuhara, 2017) tales como flavonoides, triterpenos y saponinas (Mencias &
Salazar, 2018). Estas especies sobresalen por su flor, la cual es la parte más atrayente de la
planta, y la que más varía en su tamaño, poseen tres sépalos y tres pétalos; de estos dos son
iguales y el otro es la parte más llamativa y se denomina labelo; cuya función es la tracción de
los insectos polinizadores, el polen es producido en la columna, y en la punta vamos a encontrar
la antera; el polen esta empaquetado (entre 4 y 8 paquetes) en masas denominadas polínios
(Mencias & Salazar, 2018). Aunque las semillas de orquídea son muy abundantes, las
orquídeas silvestres son bastante raras, ya que sus semillas están desprovistas de endospermo
y se hace difícil su germinación en condiciones naturales (S. N. T. M. N. Banerjee, 2013; T.
M. S. A. N. Banerjee, 2016; Hariyanto, 2015), lo que permite la conservación de especies de
orquídeas en peligro utilizando métodos in vitro. Esta situación muy similar al de otras
especies de plantas y requiere superar los desafíos debido al poco material vegetal disponible
(Ying Chena, 2015). Las técnicas de cultivo in vitro proporcionan un sistema práctico para la
multiplicación de especies de interés (Bhutani, 2016; Fracchia & Sede, 2016; Hariyanto, 2015;
Restanto, Santoso, Kriswanto, & Supardjono, 2016; Sameera, 2016; Vudala & Ribas, 2017).
La recolección y almacenamiento de germoplasma de orquídeas permite una conservación ex
situ segura (Merritt, Hay, Swarts, Sommerville, & Dixon, 2014). En 1984 en la Conferencia
Mundial de Orquídeas de Miami se acordó que el banco de semillas de orquídeas tenía el
potencial de hacer una contribución invaluable a la conservación (Pritchard, 2011). El interés
mundial por la conservación de orquídeas coincide con tiempos prósperos para el cultivo in
vitro. Existen muchas especies que están representadas por muy pocas poblaciones naturales y
están amenazadas por la destrucción del hábitat en sus diferentes formas (Calderón Sáenz,
2006; Vij, 2013), muchas de ellas pertenecientes al género Epidendrum (sinónimo de
Prosthechea) y registradas en el libro rojo de plantas de Colombia. El avance del conocimiento
es la clave principal de las acciones relacionadas con la conservación y la exploración
económica de los grandes bosques tropicales del mundo. La construcción de un escenario
basado en información sobre biodiversidad puede tener como objetivo establecer un plan
estratégico para el uso de especies de potencial económico, incluyendo orquídeas nativas
(Oliveira; & Silva, 2016). Dentro de la metas del Plan de Acción para el Estudio y la
Conservación de las Orquídeas de Colombia (Betancur, 2015), se establece como meta dentro
4
de la primera línea de investigación, ampliar el conocimiento sobre la historia natural de las
orquídeas (Pradhan et al., 2014); generar investigaciones sobre los diferentes tipos de
reproducción y propagación de las orquídeas que exigen como resultado publicaciones cuya
responsabilidad recae en Universidades, instituciones de investigación, asociaciones de
orquideología, jardines botánicos, empresa privada, Corporación Colombiana de
Investigaciones Agropecuarias en un plazo no superior a 2024. También se debe garantizar la
variabilidad genética de las especies de orquídeas nativas en bancos de germoplasma para su
reproducción in vitro. Es importante incrementar el número de colecciones vivas de orquídeas,
especialmente aquellas que hayan sido priorizadas o consideradas objeto de conservación. Se
espera como resultado nuevas colecciones de germoplasma de especies nativas y también esta
responsabilidad recae sobre los mismos entes enunciados anteriormente con plazo a 2025.
Incluso existe una tercera línea de investigación que permite fomentar el cultivo a gran escala
de orquídeas nativas; consiste en elaborar protocolos de propagación de orquídeas y sus
micorrizas a través de métodos convencionales o in vitro estandarizados. Los resultados
esperados corresponden a protocolos de propagación de plantas y micorrizas y es
responsabilidad de los mismos entes citados en la primera línea de investigación (Betancur,
2015). Es así como los esfuerzos se dirigen al diseño de un medio versátil que permita la
propagación de un gran número de géneros diferentes de la familia Orchidaceae con el fin de
suministrar continuamente el material vegetal suficiente y satisfacer las necesidades de rotación
propias de un banco de germoplasma. Buscando el éxito, este proceso debe ir acompañado de
un protocolo de desinfección adecuado, siembra y subcultivo que garanticen toda la asepsia
necesaria para desarrollar el cultivo in vitro de tejidos vegetales; en este caso la germinación
asimbiótica de semillas de diferentes géneros (T. M. S. A. N. Banerjee, 2016; Bhutani, 2016;
Chen, Goodale, Fan, & Gao, 2015; Gupta, 2016; Hariyanto, 2015; Vudala & Ribas, 2017; Ying
Chena, 2015). Finalmente, se plantea el sistema de adaptación en campo para definir la última
rotación de los tejidos vegetales en el banco de germoplasma, para ofrecer material vegetal de
alta calidad y capaz de sobrevivir con diferentes fuentes de carbono (Bhutani, 2016; Gupta,
2016).
Materiales y Métodos
Material Vegetal
Se usaron cápsulas inmaduras de orquídeas epífitas de Prosthechea fragrans
(Sw.) W.E.Higgins, recolectadas en paisajes propios del eje cafetero, en áreas rurales del
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municipio de Pereira, Risaralda (Col), donde se presenta una precipitación media anual de 2750
mm y una altura sobre el nivel del mar que oscila entre 1250-1550 msnm, una temperatura
media de 18,8 °C y una humedad relativa de 76,6 %. Las cápsulas fueron llevadas al laboratorio
en bolsas de polietileno con cierre hermético, después fueron lavadas con detergente para luego
sumergirlas en etanol al 70% durante 5 minutos. Posteriormente fueron lavadas con abundante
agua y almacenadas en refrigerador a 6°C durante 24 horas.
Esterilización Superficial de las Cápsulas
De acuerdo con estas observaciones, se realizó el siguiente protocolo de desinfección
sobre cápsulas inmaduras: 2 Inmersiones en hipoclorito de sodio al 2,5%; concentración
cercana a algunas publicadas en la literatura donde llegan a ser hasta del 4% (Bhutani, 2016);
durante 5 minutos y enjuagues con abundante agua destilada desionizada estéril (ADDE)
durante 2 minutos realizando la segunda parte en cabina de flujo laminar. Cabe resaltar la
importancia de una etapa apropiada en la cual la cápsula debe ser cosechada (Gupta, 2016), de
ahí que se hable de cápsulas inmaduras. En las referencias se encuentra que las cápsulas de
semilla pueden ser cosechadas a los 75 días después de la polinización cruzada (Suh, 2016)
Apertura de Cápsulas y Siembra de Semillas
Exposición de la semilla: se sostiene por la base y se realizan cortes longitudinales con
bisturí quirúrgico a lo largo de las uniones (Utami et al., 2017). Luego desde uno de los
extremos se desprende la superficie de la cápsula sosteniéndola con firmeza de uno de los
extremos. Se procede a desprender con una pinza las semillas que caen por efecto de la
gravedad sobre la superficie del medio de cultivo. La estructura y el tamaño de la semilla se
encuentran entre las características más llamativas de las orquídeas. Las semillas de orquídeas
son muy pequeñas (0.05-6.0 mm de largo y 0.01-0.9 mm de diámetro), extremadamente ligeras,
6
y se producen en gran cantidad (50-4,000,000 por cápsula) (Gupta, 2016). Una vez extraídas
las semillas se tomó una muestra para observación obteniendo imágenes en microscopio
compuesto marca Carl Zeiss Axio Scope A1. Para la siembra, se dispuso en la cabina de flujo
laminar, lotes de 20 frascos con 25 ml de medio previamente esterilizados. Cada frasco fue
flameado antes y después de destapar. Para esta etapa fue necesario el uso de una pinza dura
para la firme sujeción de la cápsula y una piza blanda para la desagregación y liberación de
semillas.
Composición 500 ml de medio de cultivo Murashige y Skoog (1962)
Macronutrientes (sólido)
Vitaminas Morel (1 ± 0.8 ml)
NH
4
NO
3
(g)
Ácido Pantoténico(g)
0,054 ± 0,001
KNO
3
(g)
Ácido Nicotínico (g)
0,056 ± 0,001
CaCl
2
2H
2
O (g)
Piridoxina (g)
0,051 ± 0,001
KH
2
PO
4
(g)
Tiamina (g)
0,051 ± 0,001
Solución Stock Micronutrientes
Biotina (g) 0,00055 ± 0,001
Sln E (ml)
Myoinositol (g)
5,002 ± 0,001
H
3
BO
3
(g)
Otros componentes
Na
2
MoO
4
2H
2
O
Sacarosa (g)
15,006 ± 0,001
CoCl
2
6H
2
O (g)
Aguade Coco (ml)
50 ± 2
KI (g)
Carbón Activado(g)
1 ± 0,001
Sln F (ml)
Agar (g)
6,000 ± 0,001
MgSO
4
7H
2
O(g)
Condiciones del
medio
MnSO
4
4H
2
O (g)
pH
5,8 ± 0,001
ZnSO
4
7H
2
O (g)
Ajuste pH
HCl/NaOH
0,1N
CuSO
4
5H
2
O (g)
Esterilización
86kPa,120°C)
Sln G (ml)
Tiempo
15 minutos
EDTA (g)
Volumen de medio por
frasco
25 ml
FeSO
4
7H
2
O (g)
Tabla 1. Se presentan los valores medios y su respectiva desviación estándar así como
detalles de la suplementación y otras condiciones referentes a la preparación del medio de
cultivo.
7
Luego se procedió con la adición de agar en caliente, una vez la solución alcanzó los
65°C y finalmente el carbón activado. Este procedimiento fue acompañado por agitación
constante en plancha de calentamiento. El medio se sirvió en caliente y esterilizó
inmediatamente. Luego de enfriado se dispuso en la cabina de flujo laminar o en contenedores
estériles dispuesto para su almacenamiento hasta el momento de la siembra incluso 2 semanas
después de su preparación conservando intactas sus características.
Todos los procedimientos de preparación de soluciones stock y medios de cultivo se
hicieron con material volumétrico y los pesos se tomaron en una balanza Ӕ ADAM. El pH se
midió en un pH-metro marca JENWAY 3520 a 5.8 ± 0.001 antes de esterilizar y el pH se ajustó
con NaOH 0,1 N o HCl 0,1 N según el caso. Los detalles del procedimiento se consultaron en
las referencias bibliográficas (Barbery Knaudt, 2011; Sameera, 2016; Suh, 2016). Los frascos
de la siembra fueron dispuestos en la sala de cultivo a temperatura ambiente de 25 ± 2 °C y un
fotoperiodo de 12:12 horas luz/oscuridad con una intensidad lumínica de 60 μmol/m
-2
/s
-2
. Se
rotaron periódicamente para una exposición homogénea a la fuente de luz durante un periodo
de 120 días, momento en el cual toda el área superficial del medio de cultivo se encuentra
ocupada por material vegetal. Los protocormos de 140 días de crecimiento fueron
subcultivados en medio MS (1962) con iguales características al proceso de germinación de
semilla; incluidos los suplementos. Después de comenzado el proceso, se preparó medio estéril
que fue distribuido en lotes de 20 frascos cada uno. Y dispuestos en la cabina de flujo laminar
para la siembra. Una vez sembrados, los frascos fueron dispuestos en la sala de cultivo a 25°C
y un fotoperiodo de 12:12 luz/oscuridad. Las poblaciones derivadas del subcultivo fueron
clasificadas en grupos de 20 frascos definidos por la fecha de siembra hasta alcanzar 240 días
de cultivo como se ha referenciado en trabajos similares (Jualang Azlan, David, Marbawi, &
Jawan, 2014). Se usaron como blancos el medio sin semillas para verificar la contaminación y
medio de cultivo sin endospermo de coco y con semilla para verificar la germinación sin
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obtener resultados positivos en ninguno de ellos. Incluso las plántulas subcultivadas en medio
sin endospermo de coco murieron luego de 45 días de cultivo sin manifestar crecimiento
alguno. El porcentaje de supervivencia se calculó con base en la siguiente fórmula:
Aclimatación.
En cuanto a las especies epifitas, las plántulas con mejores raíces y apariencia en general
fueron separadas de su frasco, algunas de ellas con 210 días y otras con 240 días de crecimiento.
Dichas plántulas fueron transferidas a frascos de vidrio con fibra de coco finamente triturada
ocupando el 40% del frasco. Los frascos fueron tapados con una película de polietileno para
mantener una humedad alta. Las plántulas fueron regadas con agua de grifo 2 veces al día y
mantenidas a la sombra con luz natural y en condiciones de invernadero. Con respecto a las
especies terrestres, las plántulas fueron trasferidas a recipientes de barro con un soporte sólido
natural con alto contenido de materia orgánica, cubierta natural de jardín y cascarilla de arroz.
Análisis Estadístico
Mediante el Análisis Estadístico Descriptivo realizado se tuvo en cuenta los parámetros de la
desviación estándar y la media para establecer el comportamiento de variables tales como el
porcentaje de supervivencia. Estos procedimientos se realizaron por medio de Microsoft Excel.
Discusión
Caracterización de las Semillas
El tamaño de las cápsulas oscila entre 4.5-5.5 cm de largo y 1.0-2.0 cm de ancho. Las
semillas fueron expuestas y desagregadas con facilidad con el uso de una pinza blanda cuando
las cápsulas tenían menos de 48 horas de almacenamiento. Después de este periodo de
9
almacenamiento, el interior de la cápsula presentaba alta humedad en comparación con una
cápsula abierta el día de la recolección.
Figura 1. Cápsulas de orquídeas recolectadas en paisajes propios del eje cafetero. Las cápsulas
de la Fotografía (A) tienen un tamaño entre 5.5-6.0 cm y corresponden a Prosthechea fragrans
(Sw.) W.E.Higgins, las cápsulas de la Fotografía (B) 4.5-5.5 cm referenciadas con Q.A.
Elaboración propia.
Las imágenes obtenidas de cuerpos alargados en forma de huso (Figura 2) como las
representaciones hechas por Arditti confirman la presencia de semillas de orquídeas (Tim Wing
Yam, 2009).
Figura 2. Fotografías de semilla de orquídeas recolectadas y observadas a través de
microscopía. La parte A corresponde con las semillas de referencia (Q.A) mientras que La parte
B y C corresponde a semillas de Prosthechea fragrans (Sw.) W.E.Higgins. Elaboración
propia.
Germinación de Semillas
10
En cuanto a la respuesta de los tejidos al medio de cultivo empleado, todas las especies
objeto de cultivo in vitro tuvieron éxito, con determinadas particularidades en cada caso, pero
en todas ellas el resultado fue la embriogénesis cigótica por germinación asimbiótica de
semilla. Luego de 8 meses de trabajo desde la siembra, con tres subcultivos en determinados
casos; el material multiplicado es abundante.
El porcentaje de supervivencia en la siembra inicial; medido como el número de frascos
libres de contaminación con evidencia de desarrollo en los tejidos vegetales, registró los
siguientes valores: 25% para las cápsulas de Prosthechea fragrans (Sw.) W.E.Higgins. y 58%
para las cápsulas de referencia Q.A. Fue evidente la actividad fotosintética con la aparición de
tejidos verdes luego del primer mes en la sala de cultivo, y como tal, la germinación de las
semillas, seguida por el rápido desarrollo de los protocormos en Prosthechea fragrans
(Sw.) W.E.Higgins, más lento en la referencia Q.A. Luego de 60 días los protocormos de
Prosthechea fragrans (Sw.) W.E.Higgins han colonizado casi por completo la superficie del
medio hasta que después de 90 días el crecimiento es principalmente vertical y alcanzaron su
máximo desarrollo hacia los 120 días de cultivo (Imagen A, B y C, Figura 3). Germinaron
algunas semillas de la referencia Q.A., dejando gran parte del área superficial del medio
disponible por lo que se cuentan algunos protocormos. Este factor influyó en la necesidad de
subcultivo considerablemente (Imagen E, Figura 3).
Figura 3. Germinación de 3 orquídeas recolectadas. Las imágenes A,B y C corresponden
a Prosthechea fragrans (Sw.) W.E.Higgins., y E corresponde a la orquídea referenciada como
Q.A. Elaboración propia.
11
Efectos del Medio de Cultivo en el Desarrollo de los Tejidos
Con respecto a la tabla 1, es importante señalar que el orden de adición de los componente
fue el siguiente: sacarosa, macronutrientes, solución E (Sln E), solución F (Sln F) y solución G
(Sln G), Vitaminas morel y el agua de coco. Se debe aforar y medir el pH. Ajustado con NaOH
0,1 N en algunas ocasiones cuando el pH estaba por debajo de 5,8 para favorecer la
solidificación del agar. Debido a que el agua de coco puede alterar el pH, es necesario ajustar
el pH luego de adicionarla.
Subcultivo
Para describir mejor los resultados obtenidos en el cultivo desarrollado presentamos la
Figura 4 con la que se orienta sobre las diferentes variantes presentadas en los tejidos y las
líneas celulares definidas.
La Figura 4 explica el proceso de cultivo in vitro en 10 pasos hasta que los tejidos
abandonan la sala de cultivo. El paso 1 corresponde a la esterilización superficial de la cápsula
y 2 considera la extracción de la semilla. El paso 3 considera la siembra de la semilla en el
medio propuesto y 4 su disposición en la sala de cultivo con las condiciones previamente
descritas. El paso 5 describe la primera evidencia de éxito con la germinación asimbiótica con
la presencia de tejidos verdes producto de la actividad fotosintética hasta llegar al paso 6 donde
se da la conversión en protocormos de germinación; luego llegamos al paso 7 donde aparece
el proceso de organogénesis y tenemos las primeras plántulas de orquídeas. El paso 8 constituye
el primer recambio de medio y la propagación masiva comienza al distribuir los tejidos de un
recipiente (hasta 300 plántulas) varios considerando una distribución adecuada de 7 plántulas
por frasco. Luego de un tiempo, las plántulas continúan con la organogénesis y desarrollan un
sistema radical y progresivamente van ganando tamaño en un proceso de desarrollo como se
muestra en el paso 9. Finalmente las plántulas con mejor apariencia comienzan el paso 10
donde deben ser aclimatadas para su establecimiento en campo. A pesar de ser tejidos derivados
de la misma cápsula, presentan diferente desarrollo resultando en tejidos muy diferentes. No
obstante, el desarrollo descrito anteriormente no es el único. También se obtuvieron plántulas
a partir del cultivo y repique de callos. De esta manera se describen dos formas de obtener
12
plántulas: por embriogénesis cigótica directa o a través de repique y cultivo de callos que
desarrollaron organogénesis y se transformaron en plántulas completas (Figura 5).
Figura 4. Descripción de las diferentes etapas de la germinación asimbiótica. Elaboración
propia
Los resultados obtenidos permiten demostrar que bajo las condiciones experimentales
propuestas en este trabajo, tres líneas de diferentes de callo se pueden llegar a diferenciar
fácilmente por su color: verde, café y blanco. Todos ellos aparecen en lugares específicos en
relación a otros tejidos. Normalmente están orientados hacia el polo basal de los tallos con
13
hojas. Los callos color café aparecen aislados y con diámetros de hasta 0,5 cm. no desarrollan
ningún tipo de organogénesis. Los callos verdes son los más grandes y se transforman
fácilmente en grupos de plántulas (ver Figura 5). Los callos blancos también se transformaron
en plántulas pero a una tasa menor en comparación con los callos verdes.
Figura 5. Lineas celulares y tejidos obtenidos en el cultivo in vitro de semillas de
orquídeas. Elaboración propia.
En cuanto al rendimiento del cultivo, el porcentaje de supervivencia promedio fue del
86%. El comportamiento de esta variable se ilustra en la Figura 6.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11
% de Supervivencia
Subcultivo
14
Figura 6. Comportamiento del % de supervivencia con base en el número de frascos libres de
contaminación durante el cultivo en relación al número total de frascos subcultivados.
Elaboración propia
Avanzado en subcultivos, el rendimiento mejora con los ajustes hechos en la
manipulación de tejidos, específicamente en el procedimiento de extracción del frasco de
origen como se ilustra en la Figura 7. Se observa en la secuencia como se invierte en frasco
para que los tejidos se extraigan a favor de la gravedad y evitando el ingreso de contaminación
por la boca del frasco de cultivo.
Figura 7. Ajustes realizados en el procedimiento de subcultivo para mejorar el rendimiento en
función del número de frascos libres de contaminación al final del proceso. Elaboración
propia.
Conclusiones
El presente trabajo ha descrito la modificación eficiente del medio de cultivo MS (1962)
y la suplementación efectiva de la regulación del crecimiento, con el fin de desarrollar un
medio versátil que permita soportar el mayor número posible de especies para la creación de
un banco de germoplasma. Así mismo, se estableció con éxito el protocolo confiable para la
germinación el desarrollo y crecimiento de semillas de orquideas de diferentes géneros
contrario a lo expuesto en otras investigaciones donde afirman que los métodos de
germinación asimbiótica in vitro tienen que ser desarrollados especie por especie puesto que
las condiciones del cultivo de tejido en cada caso son en gran parte específicas de la especie
15
(Ying Chena, 2015). La adopción de esta técnica in vitro de germinación asimbiótica de
semillas puede servir para satisfacer la demanda de la industria de la floricultura, así como
para fines de conservación.
Agradecimientos
Agradecemos a la Universidad Tecnológica de Pereira (UTP) y al Instituto de
Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia (IBUN) por su asistencia técnica y
científica y en especial a Tecnoparque-SENA Nodo Pereira, organismo que además acompañó
todo el proceso como principal fuente de financiación.
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